Η διθειοθρεϊτόλη (DTT) είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος αναγωγικός παράγοντας, γνωστός και ως το νέο πράσινο πρόσθετο.Είναι μια μικρή μοριακή οργανική ένωση με δύο ομάδες μερκαπτάνης (-SH).Λόγω των αναγωγικών ιδιοτήτων και της σταθερότητάς του, το DTT χρησιμοποιείται ευρέως σε πειράματα βιοχημείας και μοριακής βιολογίας.
Ο κύριος ρόλος του DTT είναι να μειώνει τους δισουλφιδικούς δεσμούς σε πρωτεΐνες και άλλα βιομόρια.Ο δισουλφιδικός δεσμός είναι ένα σημαντικό μέρος της αναδίπλωσης και της σταθερότητας των πρωτεϊνών, αλλά κάτω από ορισμένες πειραματικές συνθήκες, όπως η αναγωγική ανάλυση SDS-PAGE, ο ανασυνδυασμός πρωτεϊνών και η αναδίπλωση, είναι απαραίτητο να μειωθεί ο δισουλφιδικός δεσμός σε δύο ομάδες θειόλης για να αποκαλυφθεί η χωρική δομή του την πρωτεΐνη.Το DTT μπορεί να αντιδράσει με δισουλφιδικούς δεσμούς για να τους αναγάγει σε ομάδες μερκαπτάνης, ανοίγοντας έτσι τη χωρική δομή της πρωτεΐνης και καθιστώντας εύκολη την ανάλυση και τον χειρισμό της.
Το DTT μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την προστασία της ενζυμικής δραστηριότητας και σταθερότητας.Σε ορισμένες αντιδράσεις που καταλύονται από ένζυμα, η δραστηριότητα του ενζύμου μπορεί να μειωθεί από το οξειδωτικό.Το DTT μπορεί να αντιδράσει με οξειδωτικά για να τα μειώσει σε αβλαβείς ουσίες, προστατεύοντας έτσι τη δραστηριότητα και τη σταθερότητα του ενζύμου.
Σε σύγκριση με τους παραδοσιακούς αναγωγικούς παράγοντες όπως η β-μερκαπτοαιθανόλη (β-ΜΕ), το DTT θεωρείται ασφαλέστερος και πιο σταθερός αναγωγικός παράγοντας.Δεν είναι μόνο σταθερό σε υδατικό διάλυμα, αλλά διατηρεί και τις αναγωγικές του ιδιότητες σε συνθήκες υψηλής θερμοκρασίας και όξινης βάσης.
Η χρήση του DTT είναι σχετικά απλή.Γενικά, το DTT διαλύεται σε ένα κατάλληλο buffer και στη συνέχεια προστίθεται στο πειραματικό σύστημα.Η βέλτιστη συγκέντρωση του DTT πρέπει να προσδιοριστεί σύμφωνα με το συγκεκριμένο πείραμα και γενικά χρησιμοποιείται στην περιοχή 0,1-1 mM.Οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις μπορούν να μειώσουν τις δυσμενείς επιπτώσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων και μπορούν να μειώσουν την κυτταροτοξικότητα λόγω της υπερέκφρασης των πρωτεϊνών-στόχων.Υψηλότερες συγκεντρώσεις μπορεί να προκαλέσουν υπερβολική μεταβολική επιβάρυνση των κυττάρων, επηρεάζοντας την κυτταρική ανάπτυξη και την αποτελεσματικότητα έκφρασης.
Ο τρόπος προσδιορισμού της βέλτιστης συγκέντρωσης μπορεί να είναι η αξιολόγηση του επιπέδου έκφρασης της πρωτεΐνης στόχου με τη διεξαγωγή δοκιμών επαγωγής IPTG σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.Δοκιμές καλλιέργειας μικρής κλίμακας μπορούν να πραγματοποιηθούν χρησιμοποιώντας μια σειρά συγκεντρώσεων IPTG (π.χ. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, κ.λπ.) και το αποτέλεσμα έκφρασης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις μπορεί να αξιολογηθεί ανιχνεύοντας το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης στόχου (π.χ. Western ανίχνευση κηλίδας ή φθορισμού).Σύμφωνα με τα πειραματικά αποτελέσματα, η συγκέντρωση με το καλύτερο αποτέλεσμα έκφρασης επιλέχθηκε ως η βέλτιστη συγκέντρωση.
Επιπλέον, μπορείτε επίσης να ανατρέξετε στη σχετική βιβλιογραφία ή στην εμπειρία άλλων εργαστηρίων για να κατανοήσετε το εύρος συγκεντρώσεων IPTG που χρησιμοποιείται συνήθως σε παρόμοιες πειραματικές συνθήκες και στη συνέχεια να βελτιστοποιήσετε και να προσαρμόσετε ανάλογα με τις πειραματικές ανάγκες.
Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η βέλτιστη συγκέντρωση μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με τα διαφορετικά συστήματα έκφρασης, τις πρωτεΐνες-στόχους και τις πειραματικές συνθήκες, επομένως είναι καλύτερο να βελτιστοποιηθεί κατά περίπτωση.
Συνοπτικά, το DTT είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος αναγωγικός παράγοντας που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μείωση των δισουλφιδικών δεσμών σε πρωτεΐνες και άλλα βιομόρια και για την προστασία της ενζυμικής δραστηριότητας και σταθερότητας.Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε πειράματα βιοχημείας και μοριακής βιολογίας.
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-28-2023