Η IPTG (ισοπροπυλ-β-D-θειογαλακτοσίδη) είναι ένα ανάλογο του υποστρώματος β-γαλακτοσιδάσης, το οποίο είναι ιδιαίτερα επαγώγιμο. Υπό την επαγωγή της IPTG, ο επαγωγέας μπορεί να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με την πρωτεΐνη καταστολέα, έτσι ώστε η διαμόρφωση της πρωτεΐνης καταστολέα να αλλάζει, έτσι ώστε να μην μπορεί να συνδυαστεί με το γονίδιο-στόχο και το γονίδιο-στόχος να εκφράζεται αποτελεσματικά. Πώς λοιπόν θα πρέπει να προσδιορίζεται η συγκέντρωση της IPTG κατά τη διάρκεια του πειράματος; Όσο μεγαλύτερη τόσο το καλύτερο;
Αρχικά, ας κατανοήσουμε την αρχή της επαγωγής IPTG: Το οπερόνιο (στοιχείο) λακτόζης του E. coli περιέχει τρία δομικά γονίδια, Z, Y και A, τα οποία κωδικοποιούν β-γαλακτοσιδάση, περμεάση και ακετυλοτρανσφεράση, αντίστοιχα. Το lacZ υδρολύει τη λακτόζη σε γλυκόζη και γαλακτόζη ή σε αλλο-λακτόζη. Το lacY επιτρέπει στη λακτόζη του περιβάλλοντος να περάσει μέσω της κυτταρικής μεμβράνης και να εισέλθει στο κύτταρο. Το lacA μεταφέρει την ακετυλομάδα από το ακετυλο-CoA σε β-γαλακτοσίδη, η οποία περιλαμβάνει την εξάλειψη της τοξικής επίδρασης. Επιπλέον, υπάρχει μια λειτουργική αλληλουχία Ο, μια αρχική αλληλουχία P και ένα ρυθμιστικό γονίδιο I. Ο κώδικας του γονιδίου I είναι μια πρωτεΐνη καταστολέα που μπορεί να συνδεθεί στη θέση Ο της αλληλουχίας χειριστή, έτσι ώστε το οπερόνιο (μετα) να καταστέλλεται και να απενεργοποιείται. Υπάρχει επίσης μια θέση σύνδεσης για την καταβολική θέση σύνδεσης πρωτεΐνης ενεργοποιητή γονιδίου-CAP ανοδικά της αρχικής αλληλουχίας P. Η αλληλουχία P, η αλληλουχία O και η θέση σύνδεσης CAP αποτελούν μαζί την ρυθμιστική περιοχή του οπερονίου lac. Τα κωδικοποιητικά γονίδια των τριών ενζύμων ρυθμίζονται από την ίδια ρυθμιστική περιοχή για να επιτευχθεί η συντονισμένη έκφραση των γονιδιακών προϊόντων.
Απουσία λακτόζης, το οπερόνιο lac (meta) βρίσκεται σε κατάσταση καταστολής. Αυτή τη στιγμή, ο καταστολέας lac που εκφράζεται από την αλληλουχία I υπό τον έλεγχο της αλληλουχίας υποκινητή PI συνδέεται με την αλληλουχία O, η οποία εμποδίζει την RNA πολυμεράση να συνδεθεί με την αλληλουχία P και αναστέλλει την έναρξη της μεταγραφής. Όταν υπάρχει λακτόζη, το οπερόνιο lac (meta) μπορεί να επαχθεί. Σε αυτό το σύστημα οπερονίου (meta), ο πραγματικός επαγωγέας δεν είναι η ίδια η λακτόζη. Η λακτόζη εισέρχεται στο κύτταρο και καταλύεται από τη β-γαλακτοσιδάση για να μετατραπεί σε αλλολακτόζη. Η τελευταία, ως μόριο επαγωγέα, συνδέεται με την πρωτεΐνη καταστολέα και αλλάζει τη διαμόρφωση της πρωτεΐνης, γεγονός που οδηγεί στην αποσύνδεση της πρωτεΐνης καταστολέα από την αλληλουχία O και στη μεταγραφή. Η ισοπροπυλθειογαλακτοσίδη (IPTG) έχει το ίδιο αποτέλεσμα με την αλλολακτόζη. Είναι ένας πολύ ισχυρός επαγωγέας, ο οποίος δεν μεταβολίζεται από βακτήρια και είναι πολύ σταθερός, επομένως χρησιμοποιείται ευρέως σε εργαστήρια.
Πώς να προσδιορίσετε τη βέλτιστη συγκέντρωση IPTG; Πάρτε για παράδειγμα το E. coli.
Το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος E. coli BL21 που περιείχε το θετικό ανασυνδυασμένο pGEX (CGRP/msCT) εμβολιάστηκε σε υγρό μέσο LB που περιείχε 50μg·mL-1 Amp και καλλιεργήθηκε όλη τη νύχτα στους 37°C. Η παραπάνω καλλιέργεια εμβολιάστηκε σε 10 φιάλες των 50mL φρέσκου υγρού μέσου LB που περιείχε 50μg·mL-1 Amp σε αναλογία 1:100 για καλλιέργεια επέκτασης και όταν η τιμή OD600 ήταν 0,6~0,8, προστέθηκε IPTG στην τελική συγκέντρωση. Είναι 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. Μετά την επαγωγή στην ίδια θερμοκρασία και τον ίδιο χρόνο, ελήφθη 1 mL του βακτηριακού διαλύματος και τα βακτηριακά κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE για να αναλυθεί η επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων IPTG στην έκφραση πρωτεΐνης και στη συνέχεια να επιλεγεί η συγκέντρωση IPTG με τη μεγαλύτερη έκφραση πρωτεΐνης.
Μετά από πειράματα, θα διαπιστωθεί ότι η συγκέντρωση IPTG δεν είναι όσο το δυνατόν μεγαλύτερη. Αυτό συμβαίνει επειδή η IPTG έχει μια ορισμένη τοξικότητα για τα βακτήρια. Η υπέρβαση της συγκέντρωσης θα σκοτώσει επίσης το κύτταρο. Γενικά, ελπίζουμε ότι όσο περισσότερη διαλυτή πρωτεΐνη εκφράζεται στο κύτταρο, τόσο το καλύτερο, αλλά σε πολλές περιπτώσεις, όταν η συγκέντρωση IPTG είναι πολύ υψηλή, θα σχηματιστεί μεγάλη ποσότητα εγκλεισμού. Το σώμα, αλλά η ποσότητα της διαλυτής πρωτεΐνης μειώνεται. Επομένως, η καταλληλότερη συγκέντρωση IPTG συχνά δεν είναι όσο μεγαλύτερη τόσο το καλύτερο, αλλά όσο χαμηλότερη είναι η συγκέντρωση.
Ο σκοπός της επαγωγής και της καλλιέργειας γενετικά τροποποιημένων στελεχών είναι η αύξηση της απόδοσης της πρωτεΐνης-στόχου και η μείωση του κόστους. Η έκφραση του γονιδίου-στόχου δεν επηρεάζεται μόνο από τους ίδιους τους παράγοντες του στελέχους και το πλασμίδιο έκφρασης, αλλά και από άλλες εξωτερικές συνθήκες, όπως η συγκέντρωση του επαγωγέα, η θερμοκρασία επαγωγής και ο χρόνος επαγωγής. Επομένως, γενικά, πριν από την έκφραση και τον καθαρισμό μιας άγνωστης πρωτεΐνης, είναι καλύτερο να μελετηθεί ο χρόνος επαγωγής, η θερμοκρασία και η συγκέντρωση IPTG, προκειμένου να επιλεγούν οι κατάλληλες συνθήκες και να επιτευχθούν τα καλύτερα πειραματικά αποτελέσματα.
Ώρα δημοσίευσης: 31 Δεκεμβρίου 2021